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Western Blotting 问题解答
1、胶片上存在反转印象(如:亮的条带、黑的背景)?

原因:HRP的浓度过高;

解决:稀释HRP至少10倍。

2、膜上有黄色或棕色的沉积?

原因:HRP的浓度过高;

解决:稀释HRP至少10倍。

3、在暗室中条带过于明亮?

原因:HRP的浓度过高;

解决:稀释HRP至少10倍。

4、条带的发光时间持续了至少8小时?

原因:HRP的浓度过高;

解决:稀释HRP至少10倍。

5、信号太弱或没有?

原因:

1.太多的HRP积聚导致信号快速的消退;

2.抗原或抗体的浓度不够;

3.转印不成功;

4.HRP或其他底物的效价降低。

解决:

1.稀释HRP至少10倍;

2.增加其浓度;

3.寻找合适的转移方法和条件;

4.选择其他的合适底物。

6、背景高?

原因:

1.HRP浓度过高;

2.封闭无效;

3.不适合的封闭试剂;

4.洗涤不充分和洗涤液的量;

5.胶片曝光过度;

6.抗原或抗体的浓度太高。

解决:

1.稀释HRP至少10倍;

2.寻找合适的封闭方法;

3.选用其他的封闭试剂;

4.增加洗涤的时间,次数;

5.减少曝光时间;

6.稀释抗原或抗体。

7、蛋白质条带上有空泡影像?

原因:

1.蛋白质没有被充分转印;

2.膜没有预先浸湿;

3.在胶片和膜之间有气泡。

解决:

1.寻找合适的转移方法和条件;

2.在转印前充分浸湿;

3.在暴光之前赶走气泡。

8、胶片上背景弥散?

原因:HRP标记的抗体出现了积聚;

解决:稀释HRP至少10倍。

9、无特异性条带?

原因:

1.HRP浓度过高;

2.SDS促使非特异蛋白质条带黏附在目的蛋白质条带上。

解决:

1.稀释HRP至少10倍;

2.在操作过程中不要加SDS。

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