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免疫组化问题解答
1、染色过强?
  • 原 因
  • 解决方法
  • 抗体浓度过高或孵育时间过长
  • 降低抗体滴度、抗体孵育时间:室温1小时或4度过夜
  • 孵育温度过高超过37度
  • 一般在室温20-28度
  • DAB显色时间过长或浓度过高
  • 显色时间不超过5-12分钟,以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色?
  • 原 因
  • 解决方法
  • 操作过程中冲洗不充分
  • 每步冲洗3次每次5分钟
  • 组织中含过氧化物酶未阻断
  • 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长
  • 组织中含内原性生物素
  • 正常非免疫动物血清再封闭
  • 血清蛋白封闭不充分
  • 血清蛋白封闭不充分
3、染色弱?
  • 原 因
  • 解决方法
  • 抗体浓度过低、孵育时间过短
  • 提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟
  • 试剂超过有效使用时间
  • 应更换试剂
  • 操作中添加试剂时缓冲液未沥干
  • 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液
    使试剂稀释 (应防止切片干燥)
  • 室温太低,低于15度
  • 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4度冰箱过夜
  • 蛋白封闭过度
  • 封闭不要超过12分钟
4、染色阴性?
  • 原 因
  • 解决方法
  • 操作步骤错误
  • 应重试,设阳性对照
  • 组织中无抗原
  • 设阳性对照以验证试验结果
  • 一抗与二抗种属连接错误
  • 仔细确定一抗二抗种属无误
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